CATALAZA

Catalaza (E.C.1.11.1.6) este universal raspandita in natura, activitatea catalazica fiind prezenta in toate microorganismele aerobe, in celulele plantelor si animalelor. A fost studiata indeosebi catalaza din drojdie (Seah, 1973) si catalaza din tesuturile animale (Masters, 1986). In celula enzima este localizata aproape exclusiv in peroxizomii majoritatii celuleor, reducand nivelul peroxidului de hidrogen. Catalaza reduce nivelul peroxidului de hidrogen in peroxizomi, dar este absenta in cloroplaste. Peroxidul de hidrogen este cea mai stabila dintre toate speciile active ale oxigenului, fiind un oxidant nucleofilic foarte puternic. Este raspunzator pentru inhibarea enzimelor din ciclul calvin. Catalaza este, alaturi de alte 2 enzime (fumaraza si aceticolineste- raza) unul dintre cei mai eficienti catalizatori cunoscuti, reactiile pe care le catalizeaza fiind esentiale pentru viata. Enzima catalizeaza o reactie de fiecare data cand intalneste o molecula de sulf. Viteza relativa si orientarile moleculelor care interactioneaza sunt foarte importante pentru reactie. Catalaza actioneaza in conversia peroxidului de hidrogen (2H2O2 2H2O + O2) care este un agent oxidant puternic, cu caracter toxic pentru celule. Catalaza permite astfel desfasurarea in bune conditii a unor importante procese celulare care produc K2O2 ca produs secundar in peroxizomi (po-oxidarea acizilor grasi, fotorespiratia Streb P. 1993 si catabolismul purinei). De asemenea ea foloseste peroxidul de hidrogen pentru a oxida toxine ca fenoli, acid formic, formaldehida si alcooli (Babardjieva N. 1997). Catalaza participa la 2 tipuri de reactii care consuma H2O2 (descompunerea apei oxigenate si reactia peroxidativa). Activitatea catalazei in celule este de aceea foarte importanta. a)Reactia peroxidativa : H2O2 + RH2 2H2O + R - inseamna indepartarea toxinelor (H2O2) prin formarea de apa si de compusi nedaunatori sau chiar folositori. Peroxizomii oxideaza partial acizii grasi producand H2O2 ca produs secundar. Oxidarea peroxizomala scurteaza acizii grasi pana la C8 si faciliteaza degradarea in mitocondrii . Reactia peroxizomala este mai putin eficienta in producerea ATP decat oxidarea mitocondriala. b)O alta reactie redox care implica indirect catalaza consta in producerea de ADN. Ribonucleotid reductaza este raspunzatoare de conversia ribonucleotid difosfatilor in dezoxiribonucleotid disfosfatii corespunzatori. Ribonucleotid reductaza are un radical liber tirosil care este esential pentru actiunea ei (Bayse & Co. 1972). Acest radical extrem de reactiv este produs de o enzima, NADPH flavin oxidoreductaza, care elibereaza ionul superoxid O si acest radical este convertit in H2O2 prin actiunea superoxid dismutazei: 2O-2 + 2H+ H2O2 + O2 H2O2 devine apoi substrat pentru catalaza. Peroxidul de Hidrogen Nomenclatura si clasificare Catalaza (peroxid de hidrogen oxidoreductaza) Cod E.C.1.11.1.6 face parte din grupa cromoproteidelor (proteine complexe care prin hidroliza pun in libertate aminoacizi si o componenta prostetica de natura protoporfirinica). Catalazele sunt cuprinse in urmatoarele clase cat-1 si cat-2 (localizate in peroxizomi; citosol) si cat-3 (in mitocondrii). Catalazele cat-2 au rol catalizator in ambele tipuri de reactii indeplinind un rol bifunctional. Catalazele HPI exista sub forma de 2 izoenzime (HPI-A si HPI-B) care sedimenteaza si separat, datorita densitatilor usor diferite. Catalaza este una dintre cele mai eficiente enzime. Limita vitezei oricarei reactii catalizate de o enzima in solutie este frecventa cu care enzima si moleculele de substrat se lovesc unele de altele. In mod convectional se considera ca enzima reactioneaza aproape de fiecare data cand intalneste o molecula de substrat. Orientarile relative ale moleculelor reactante sunt foarte importante pentru desfasurarea reactiei. Functia si rolul fiziologic al catalazei Catalaza are in mod distinct 2 roluri catalitice, fiecare implicand H2O2. Intrucat atomul de fier din gruparea heminica prostetica participa in mod sigur la partea activa rezulta ca aceasta zona are 2 functionalitati. Numai un singur atom de carbon din radicalul R din reactia peroxidativa este implicat in formarea si desfacerea legaturilor. In reactia peroxidativa tipurile de catalaze se comporta diferit. Functia principala a catalazei este aceea de a cataliza descompunerea H2O2. Aceasta enzima are diferite roluri fiziologice, de exemplu, localizata in organite actioneaza ca un reglator al nivelului H2O2 (ca o peroxidaza specifica). Catalaza, prezenta in peroxizomii tuturor celulelor aerobe, manifesta de asemenea si un rol detoxifiant, deoarece apa oxigenata are un efect toxic asupra tesuturilor; in acest sens, ea protejeaza celula de efectele toxice ale peroxidului de hidrogen prin catalizarea descompunerii apei oxigenate formata in celule sub actiunea dehidrogenazelor aerobe. Cantitatea mare de catalaza din ficat si hematii justifica implicarea ei in procese unde se produc cantitati crescute de H2O2. Formarea H2O2 este foarte riguros controlata in organisme, pentru descompunerea acesteia actionnd trei enzime: catalaza, GSH peroxidaza si peroxidazele. Asa se explica de ce in deficite congenitale ale uneia dintre ele, persoanele respective nu au prea mult de suferit. Acest deficit devine decelabil clinic in conditii de stres oxidativ, infectii, cand se produc afte sau ulceratii in cavitatea bucala din cauza dezvoltarii unor bacterii ce secreta mult H2O2, capacitatea antioxidanta enzimatica fiind depasita. Catalaza ajuta n prevenirea modificrilor distructive la nivel celular, cum ar fi ruperea lanului ADN care poate duce, eventual, la diferite forme de cancer sau la alte boli cronice i degenerative. Actiunea factorilor de stres asupra catalazei Catalaza este implicata in reactia celulelor vegetale la factorii de stres ai mediului. Au fost studiate rolul si modificarea actiunii catalazei in functie si de alte conditii de stres ale mediului, ca : racirea, temperaturi mari, variatia concentratiei de ozon si SO2. Willekens (1904) a aratat ca raspunsul catalazei si al glutation peroxidazei este mult mai prompt la stresul cauzat de SO2, UB-B si Ozon decat raspunsul superoxid dismutazei si al ascorbatoxidazei. Un factor de stres foarte important in ceea ce priveste catalaza este intensitatea luminii. Structura catalazei Catalaza are o structura asemanatoare cu peroxidazele : este o enzima feroporfirinica in a carei structura intra 4 nuclee pirolice si un ion Fe3+. Continutul in protohem este 1,1%. Catalaza purificata de Stausell (1965) are un continut in fier de 0,09%. Catalazele contin 4 unitati tetramere identice cu mase moleculare cuprinse intre 220000 si 250000 g/mol. Nu pare sa fie o diferenta mare intre catalazele extrase din diferite surse (mamifere, plante, microorganisme) cel putin in ceea ce priveste gruparea prostetica. Apoproteina este formata dintr-un lant polipeptidic/ /subunitate hem si contine 16 grupari SH, din care 10 apar numai dupa denaturare acida. Datorita acestui continut mare in grupari SH, catalaza este inhibata de o serie de tioli cum sunt glutationul sau cisteina. Glutationul ar putea fi si unul dintre modulatorii activitatii enzimatice a catalazei. Activitatea catalazei nu este inhibata prin titrarea celor 6 grame SH, dar cea peroxidazica este mult redusa. Actiunea SH se datoreaza producerii unor moduri conformationale pe calea stabilirii unor disulfuri mixte reversibile. Atomul central de fier din hem este in stare trivalenta si nu sufera modificari de valenta in cursul reactiei enzimatice. A 5-a valenta coordinativa a fierului este implicata in legaturi cu apoproteina prin intermediul histidinei, iar cea de a 6-a valenta este legata de o molecula de apa. Natura legaturii dintre porfirina si partea proteica este necovalenta. Structura catalazei a fost stabilita prin difractia cu raze X. Fiind proteina, catalaza prezinta structura primara (contine un lant polimeric compus din 506 aminoacizi, o grupare heminica si o molecula de NADH), o structura secundara helicoidala (26% de si 12% de ), o structura tertiara (compusa din monomeri cu un numar diferit de rezidii terminale) si o structura cuaternara. Nu se cunosc izoenzime ale catalazei. S-a descris si aparitia unor fractiuni electroforetice distincte, dar acestea par sa fie rezultatul denaturarilor produse in cursul purificarii; de altfel, mobilitatea electroforetica variaza mult in timpul pastrarii enzimei. Denaturari blande (liofilizarea) produc disocierea catalazei in forme active; de altfel toate formele de denaturare produc fragmentari mai mult sau mai putin reversibile. Activitatea catalazei Catalaza este inrudita din punct de vedere structural si functional cu peroxidaza (ca si peroxidaza, este tot o hemoproteina), insa actioneaza asupra apei oxigenate avand acceptori de electroni diferiti. Astfel ea actioneaza asupra apei oxigenate descompunand-o in apa si oxigen molecular, in timp ce peroxidaza poate utiliza ca acceptor al oxigenului atomic diverse substante : acid ascorbic, glutation, fenoli. Catalazele utilizeaza o molecula de H2O2 ca substrat donator de electroni si o alta molecula de H2O2 ca oxidant sau acceptor de electroni cu punere in libertate de oxigen molecular. Este o enzima destul de activa. Ea descompune de 10 miliarde de ori mai repede H2O2 decat FeCl3 (un mol de catalaza descompune 5-1000000 moli H2O2/minut). In concluzie, catalaza utilizeaza H2O2 atat ca substrat cat si ca acceptor de H2, in timp ce peroxidaza necesita un acceptor separat, aparand astfel o diferenta de reactivitate intre cele 2 enzime. H2O2 + H2O2 catalaze 2H2O2 + O2 H2O2 + H2O2 peroxidaze 2H2O + O Chance si Bonnichsen (1945) au subliniat necesitatea masurarii activitatii catalazei in maxim un minut, datorita extraordinarei viteze de reatie (in primele 15 secunde mai mult de 1/2 din cantitatea initiala de H2O2 este descompusa). Ei au determinat experimental ca prin incubare se produce o considerabila inactivare a enzimei de catre substrat si de aceea se foloseste o ratie relativ mare Enzima-Substrat. Extinctia la 405 nm (banda Soret) este utila pentru a determina concentratia catalazei. Coeficientul de extinctie milimolar are valoarea 380-400 per mol de enzima sau per grupare hem. Puritatea preparatelor enzimatice se exprima mai des prin prin raportul absorbtiilor E280/E405 datorita apoproteinei si respectiv hem-ului, raport care in cazul unei enime pure trebuie sa fie 0,9. Enzima este livrabila comercial sub forma cristalina, cat si liofilizata. Ca in cazul electroforezei, separarea cromatografica pe coloana prezinta 3 maxime, sugerand forme moleculare multiple. Din cele 3 maxime, 2 s-au dovedit insa a fi produse ale oxidarii secundare din timpul purificarii. Tabelul urmator prezinta principalii agenti disociati ai catalazei (Jones 1968 si Somejima 1968). Se observa ca in functie de natura agentului denaturat, se obtine disocierea catalazei in diferiti componenti cu mase moleculare variabile. Aceasta disociere este reversibila in anumite limite. Catalaza disociaza sub actiunea ureei sau prin inghetare. In urma disocierii, proprietatile spectrale sunt modificate, dar activitatea se pastreaza. Disocierea catalazei si principalii agenti disocianti Agent denaturant Nr componenti Fragmente masa moleculara Guanidina-HCl 5mM2140000 Guanidina-mercaptoetanil 0,1M4 50000 Anhidrina succinica4 65000 Dodecilsulfat 15mM2 80000 Dodecilsulfat pH alcalin - 12,04 3 8 54 67000 Acid formic + Dodecilsulfat4 60000 Uree 8mM2133000 Liofilizare2213000 Liofilizare pH acid - 3,03250000 In concluzie, in afara de peroxidaza, reactiile peroxidative mai pot fi catalizate si de catalaza cu anumite substante (fenoli, alcooli cu masa moleculara mica, hemoglobina si diversi compusi anorganici). Catalaza de referinta Dintre numeroasele tipuri de catalaze (cu structuri asemanatoare) a fost izolata si caracterizata in totalitate numai catalaza provenita din ficat de bovina, care are urmatoarele caracteristici : -PH optim ? 7,0 -Punct izoelectric 5,4 -Stabilitate 6 12 luni la temperatura de 5?C. Preparatele lichide nu se supun inghetarii -Catalaza este inhibata de ascorbat, atat singur cat si impreuna cu cationi de cupru divalent -Inghetarea si liofilizarea provoaca inactivarea -Nu necesita activatori sau cofactori -Cu toate ca studiile de difuzie si centrifugare au indicat omogenitatea catalazei, s-au descoperit 3 izoenzime ce variaza prin numar de subunitati.

Dr medic Karol Chami